人參屬藥材因皂苷類成分的廣泛藥理活性而受到關(guān)注與研究，國內(nèi)外學(xué)者研究主要集中于皂苷類成分分離與鑒定、藥理作用和質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面，亦有用液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用法對(duì)竹節(jié)參皂苷類成分進(jìn)行定性分析的研究報(bào)道，共定性或鑒定出13 個(gè)皂苷類成分。竹節(jié)參中皂苷類成分常見的分析方法主要有高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）法、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）及LCMS等。HPLC法操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高，主要用于皂苷類成分的含量測(cè)定；NMR作為一種對(duì)已知或未知化合物具有較強(qiáng)結(jié)構(gòu)解析能力的檢測(cè)手段，多用于對(duì)未知化合物的結(jié)構(gòu)分析鑒定，但NMR大多需對(duì)樣品進(jìn)行較復(fù)雜且耗時(shí)的提取、分離等前處理步驟；LC-MS樣品前處理簡(jiǎn)單，而且集LC高分離能力、MS高靈敏度和高選擇性于一體，對(duì)已知或未知化合物均可較準(zhǔn)確地分析與鑒定，已廣泛應(yīng)用于中藥的定性與定量分析。

本研究采用超快速液相色譜-三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)竹節(jié)參中皂苷類成分進(jìn)行分析，根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子及其產(chǎn)生的碎片離子精確分子質(zhì)量、色譜保留時(shí)間，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)與參考相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，初步鑒定出原人參二醇型、原人參三醇型、齊墩果烷型及奧寇梯木醇型共53 種皂苷成分，并推測(cè)其可能的裂解途徑及規(guī)律，旨在探究竹節(jié)參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和建立其藥材品質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)體系提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg2(20S)、人參皂苷Rh1（20S）、人參皂苷Rc、人參皂苷Rh1(20R) 、人參皂苷Ro。

竹節(jié)參樣品：于2017年10月采自湖北省恩施市栽培基地（北緯30°3’49"，東經(jīng)109°51’41"），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定為五加科植物竹節(jié)參（Panax japonicus C.A.Mey.）的根莖。

甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純） 德國默克公司；甲醇（批號(hào)：143135）（色譜純） 江蘇漢邦科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SIL-20A XR UFLC儀 日本Shimadzu公司；Triple TOFTM5600 System-MS/MS高分辨四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（配有Peakview 1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，電噴霧離子源） 美國AB Sciex公司；ME36S型電子分析天平（1/100萬）、BSA2245型電子分析天平（1/10萬） 德國賽多利斯公司；Q-500B高速多功能粉碎機(jī) 上海冰都電器有限公司；KQ-500B超聲波清洗機(jī)（500 W、40 kHz） 昆山超聲儀器有限公司；H1650-W高速離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Milli-Q超純水制備儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱SynergiTM Hydro-RP 100 ?柱（2.0 mm×100 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相0.1%甲酸-水（A）-0.1%甲酸-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～10 min，10%～35% B；10～14 min，35%～42% B；14～24 min，42%～95% B；柱溫40 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量2.0 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 500；離子源溫度550 ℃；氣簾氣流速40 L/min；霧化氣流速55 L/min；輔助氣流速55 L/min；噴霧電壓-4 500 V；去簇電壓-100 V。

1.3.3 對(duì)照品溶液制備

分別取各對(duì)照品適量，精密稱定，置于5 mL容量瓶中，加70%甲醇溶液溶解制成對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇溶液溶解制成5 μg/mL混合對(duì)照品溶液。

1.3.4 供試品溶液制備

精密稱定樣品粉末0.5 g（過60 目篩），置于25 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液10 mL，密閉，稱質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）60 min，放置冷卻，再次稱質(zhì)量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足質(zhì)量損失，搖勻，過濾，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Peakview 1.2軟件進(jìn)行處理，裂解途徑推導(dǎo)圖采用ChemDraw Ultra 7.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹節(jié)參中皂苷類成分結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 竹節(jié)參70%甲醇溶液提取物在負(fù)離子模式下的基峰圖

按照1.3節(jié)實(shí)驗(yàn)條件對(duì)竹節(jié)參中皂苷類成分進(jìn)行分離與分析，如圖1所示。通過供試品的色譜保留時(shí)間，高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子峰及碎片離子峰精確分子質(zhì)量信息，與對(duì)照品比對(duì)，確定了23 個(gè)皂苷成分；根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的精確分子質(zhì)量，確定可能分子結(jié)構(gòu)式，再依據(jù)碎片離子信息，參考相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，并結(jié)合HDMB數(shù)據(jù)庫檢索，共推測(cè)出30 個(gè)皂苷成分。

2.2 皂苷類成分的質(zhì)譜解析

圖2 竹節(jié)參中皂苷結(jié)構(gòu)類型

竹節(jié)參中皂苷類型主要有原人參二醇型、原人參三醇型、齊墩果烷型、奧寇梯木醇型，如圖2所示。多數(shù)皂苷含有至少一個(gè)糖鏈，一般在不同取代位置上與葡萄糖（Glc）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）等單糖或寡糖相連。皂苷類成分苷元部分較為穩(wěn)定，一般較大壓力下也僅失去糖碎片（162、146、132 u），多數(shù)皂苷中呈現(xiàn)相似的單糖或寡糖碎片裂解規(guī)律。例如，人參皂苷Rb1（化合物21）的裂解碎片中除表1碎片m/z 945、783、765、621、459，還可觀察到碎片m/z 323、221、179、161、119、101，其中，m/z 323、221可以推斷為Glc-Glc裂解產(chǎn)生的碎片，m/z 179、161、119、101可以推斷為Glc裂解產(chǎn)生的碎片。

2.2.1 原人參二醇型皂苷

以人參皂苷Rb1、人參皂苷Rs3、人參皂苷Rg3(20R)為例說明裂解途徑。化合物21的保留時(shí)間為11.76 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 1 107.599 5[M-H]-，分別失去1、2、3、4分子Glc得到碎片離子m/z 945、783、621、459，失去2分子Glc和1分子H2O得到碎片離子m/z 765。

化合物47的保留時(shí)間為17.22 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 871.509 1[M+HCOO]-，失去C-3位上糖基連有的1分子乙酰基（Ac）得到碎片離子m/z 783，繼而失去1分子H2O得到碎片離子m/z 765，失去C-3位上糖基連有的1分子Ac、1分子Glc得到碎片離子m/z 621，再失去1分子Glc得到碎片離子m/z 459，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推測(cè)為人參皂苷Rs3。

2.2.2 原人參三醇型皂苷

以丙二酰基人參皂苷Rg1、三七皂苷R2(20S)、人參皂苷Rf為例說明裂解途徑。化合物10的保留時(shí)間8.71 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 885.488 4[M-H]-，失去C-6位上的1分子CO2得到碎片離子m/z 841，失去C-6位上糖基連有的1分子丙二酰基（Ma）得到碎片離子m/z 799，再失去1分子H2O得到碎片離子m/z 781，失去C-6位上的1分子Ma、1分子Glc得到碎片離子m/z 637，再失去1分子H2O得到碎片離子m/z 619，失去C-6位上的1分子Ma、C-6和C-20位上各1分子Glc得到苷元碎片離子m/z 475。通過與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)推測(cè)為丙二酰基人參皂苷Rg1。

化合物15的保留時(shí)間為10.91 min，其準(zhǔn)分子離子峰m/z 845.492 2[M+HCOO]-，分別失去C-6位上的1、2分子Glc得到碎片離子m/z 637、475。通過與對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)確定為人參皂苷Rf。

2.2.3 齊墩果烷型皂苷

共鑒定了10 個(gè)齊墩果烷型皂苷，分別為表1中的化合物12、27、29、31、33、34、36、37、49和51。齊墩果烷型皂苷在一級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生較強(qiáng)的[M+HCOO]-、[M-H]-離子，二級(jí)質(zhì)譜中C-3(R)、C-28酯基(R2)位上的糖基取代基不同程度地裂解。

以竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、齊墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖為例說明其裂解途徑。化合物34的保留時(shí)間為13.06 min，準(zhǔn)分子離子峰為925.483 5[M-H]-，失去C-28酯基相連的1分子Glc、C-3位上與GlcUA相連的1分子Ara和1分子H2O，得到碎片離子m/z 613，再失去GlcUA上的1分子CO2得到碎片離子m/z 569。通過與對(duì)照品比對(duì)，并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)后確定為竹節(jié)參皂苷IV。

2.2.4 奧寇梯木醇型皂苷

共鑒定了4 個(gè)奧寇梯木醇型皂苷，分別為表1中的化合物1、2、13和14。奧寇梯木醇型皂苷在一級(jí)質(zhì)譜中多產(chǎn)生較強(qiáng)的[M+HCOO]-離子，二級(jí)質(zhì)譜中C-6(R1)位上的糖基取代基不同程度地裂解。

化合物2的保留時(shí)間為6.91 min，其準(zhǔn)分子離子峰子m/z 861.486 5[M+HCOO]-，分別失去1、2分子Glc得到碎片離子m/z 653、491，珠子參苷R1的裂解途徑如圖3A所示。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)，推測(cè)化合物2為珠子參苷R1。

化合物1、13、14的保留時(shí)間分別為5.28、10.61、10.87 min，準(zhǔn)分子離子峰分別為子m/z 1 023.541 4[M+HCOO]-、831.477 7[M+HCOO]-、845.493 1[M+HCOO]-，分別失去2分子Glc、1分子Xyl、1分子Rha得到碎片離子m/z 653，通過與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)推測(cè)化合物1、13分別為葉三七皂苷B、珠子參苷R2/假人參皂苷RT2，與對(duì)照品對(duì)照并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)確定化合物14為擬人參皂苷F11。

通過對(duì)上述4 個(gè)奧寇梯木醇型皂苷裂解規(guī)律的推測(cè)與比對(duì)，可知奧寇梯木醇型皂苷母核較穩(wěn)定，一般斷裂為糖碎片，易產(chǎn)生m/z 653[C36H61O10]-的碎片離子，最終可能會(huì)產(chǎn)生m/z 491 [C30H51O5]-的特征碎片離子，奧寇梯木醇型皂苷的裂解途徑如圖3B所示。

圖3 珠子參苷R1（A）和奧寇梯木醇型皂苷（B）的裂解途徑

3 結(jié) 論

UFLC-Triple TOF MS/MS技術(shù)可提供準(zhǔn)分子離子及碎片離子的元素組成等結(jié)構(gòu)信息，提高結(jié)構(gòu)解析的準(zhǔn)確性及分析速率，易于發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)分析中被遺漏或者忽略的化合物，在中藥復(fù)雜組分的鑒定研究中具有一定優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用前景。但該多級(jí)質(zhì)譜分析技術(shù)在結(jié)構(gòu)鑒定及裂解方面仍然存在一定局限性。例如，取代基取代不同位點(diǎn)的同分異構(gòu)體難以確認(rèn)，取代基上基團(tuán)斷裂位置及順序尚不能確定，裂解途徑的合理解釋等相關(guān)文獻(xiàn)較少。因此，采用UFLC-Triple TOF MS/MS技術(shù)對(duì)化合物結(jié)構(gòu)鑒定及裂解推導(dǎo)仍需進(jìn)一步研究，通過歸納相關(guān)化合物裂解方式及規(guī)律，為中藥中相似成分的結(jié)構(gòu)分析提供理論依據(jù)。

本研究采用UFLC-Triple TOF MS/MS技術(shù)對(duì)竹節(jié)參中皂苷類成分進(jìn)行分析，根據(jù)相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、對(duì)照品及文獻(xiàn)，初步鑒定出原人參二醇型、原人參三醇型、齊墩果烷型及奧寇梯木醇型共53 種皂苷成分并推測(cè)其可能裂解途徑及規(guī)律，以期進(jìn)一步探究竹節(jié)參藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及建立其品質(zhì)評(píng)價(jià)體系。